Anticorpi antinucleari (ANA, ANA, anticorpi antinucleari, factor antinuclear-ANF) - metoda NIF pe linia celulară HEp-2 cu determinarea tipului de luminescență.- un indicator al bolilor autoimune ale țesutului conjunctiv. ANA este un grup de autoanticorpi la proteine ​​și alte componente (inclusiv ADN) găsite în nucleii celulari. Principalele indicații de utilizare: excluderea diagnosticului - lupus eritematos sistemic (se crede că ANA apar în 90% din cazurile de LES, cu alte cuvinte, un rezultat negativ cu o probabilitate de aproximativ 90% exclude diagnosticul de LES), diagnostic diferentiat colagenoze sistemice (lupus eritematos sistemic, sclerodermie, periarterita nodoasă, dermatomiozită), hepatită cronică activă.

Până în prezent, au fost descrise peste 200 de soiuri de ANA, îndreptate împotriva acizilor nucleici, histonelor, proteinelor membranei nucleare, componentelor spliceozomilor, ribonucleoroproteinelor, proteinelor nucleolare și centromere. În același timp, acestea afectează țesutul conjunctiv, ceea ce a contribuit la introducerea determinării factorului antinuclear ca test pentru bolile sistemice ale țesutului conjunctiv. Termenul „factor antinuclear” se referă la un test pentru detectarea anticorpilor antinucleari folosind metoda imunofluorescenței indirecte.

Una dintre metodele de detectare a factorului antinuclear în sânge (anticorpi antinucleari) este metoda imunofluorescenței indirecte prin aplicarea serului pacientului pe celulele tisulare ale liniei celulare umane continue HEp-2 (carcinom epitelial uman al celulelor laringelui Hep-2). linie, care conține diverși antigeni nucleari), folosind un conjugat marcat cu anticorpi umani. Alte linii celulare umane pot fi, de asemenea, utilizate ca substraturi, dar datorită morfologiei lor bune și ușurinței de cultivare, Hep-2 a devenit un substrat general acceptat pentru imunofluorescența indirectă. O metodă pentru detectarea ANF a fost dezvoltată de Tan în 1982, folosind linia de celule epitelioide umane continuă HEp-2 ca substrat. Această linie celulară, derivată din adenocarcinomul laringian uman, este o celulă epitelială scuamoasă poliploidă mare, nekeratinizantă, care formează un monostrat pe sticlă. Serul pacientului este incubat cu substratul tisular, iar anticorpii antinucleari din serul pacientului (dacă sunt prezenti) se leagă de antigenele nucleare corespunzătoare. Siturile de legare a autoanticorpilor sunt detectate utilizând antiser anti-uman marcat cu fluoresceină. Rezultatele reacției sunt evaluate prin microscopie folosind un microscop luminiscent și evaluarea vizuală a naturii luminiscenței anticorpilor legați. Printre avantajele HEp-2 (în comparație cu criosecția țesuturilor animale) se remarcă frecvența ridicată a diviziunii celulare, care face posibilă detectarea anticorpilor la antigenele exprimate numai în timpul diviziunii celulare și absența unei matrice celulare tisulare, ceea ce face dificilă vizualizarea luminiscenței specifice în comparație cu secțiunile histologice. În unele boli, cum ar fi LES, sclerodermia sistemică (scleroza sistemică) și unele infecții, sistemul imunitar al pacientului percepe nucleii (proteinele nucleare) ale celulelor proprii ale țesutului ca fiind străini și produce anticorpi împotriva acestora (anticorpi antinucleari - AHA). În același timp, acestea afectează țesutul conjunctiv, ceea ce a contribuit la introducerea determinării factorului antinuclear ca test pentru bolile sistemice ale țesutului conjunctiv.

La interpretarea datelor, trebuie luat în considerare faptul că spectrul AHA include un grup mare de autoanticorpi la ADN, nucleoproteine, histone, ribonucleoproteine ​​nucleare și alte componente nucleare. Astfel, testul își propune să detecteze diverși anticorpi la componentele nucleare și citoplasmatice care au fost descoperite pentru prima dată în LES. Mai departe criterii de diagnostic Testul a fost extins datorită descoperirii acestor anticorpi în alte boli ale țesutului conjunctiv.

Testele de screening pentru determinarea ANA totală folosesc de obicei un set de următoarele antigene, care sunt principalii markeri ai bolilor autoimune ale țesutului conjunctiv: SS-A (Ro), SS-B (La), BNP70, Sm, RNP/Sm, J01, centromerul B.
Principalii antigeni utilizați în kiturile moderne pentru detectarea anticorpilor nucleari din clasa IgG sunt reprezentați de următorul set:

1. SS-A (Ro) - ribonucleoproteine ​​nucleare (polipeptide). Anticorpii împotriva acestora se găsesc mai des în sclerodermia sistemică (60% din cazuri), sindromul Sjögren (până la 70% din cazuri) și în LES (până la 30% din cazuri). Se crede că, dacă acești anticorpi sunt detectați în sângele femeilor însărcinate, acesta este un indicator al riscului de creștere a apariției sindromului asemănător lupusului neonatal la un nou-născut (sindromul lupus neonatal). Acești anticorpi materni traversează placenta și provoacă leziuni ale fătului, ducând la anemie hemolitică și trombocitopenie. Consecințele grave includ deteriorarea sistemului de conducere al inimii copilului (până la stimularea cardiacă permanentă). S-a remarcat că la femeile care au avut un titru semnificativ al acestor anticorpi în timpul sarcinii, fără evident semne clinice, dezvoltă ulterior orice boală autoimună, inclusiv LES.
2. SS-B (La) - proteine ​​nucleare. Anticorpii împotriva acestora sunt detectați în până la 60% din cazurile cu sindromul Sjogren și în 15% din cazurile cu LES.
3. Scl-70 este o proteină enzimatică implicată în metabolismul acizilor nucleici (topoizomeraza-1). Anticorpii la această proteină sunt cei mai specifici în sclerodermia sistemică (până la 70% din cazuri).
4. ADN-ul dublu catenar este ADN nativ. Anticorpii la ADN sunt cei mai specifici în LES (până la 80% din cazuri) și sunt practic nedetectabili în artrita reumatoidă și sclerodermie.
5. RNP/Sm - Complexul antigen RNP/Sm este format din U1-ribonucleoproteine: U1-68, U1-A, U1-C, U5, U6; și, de asemenea, din polipeptide Sm: SmA | , SmB | B, SmD, SmE, SmF, SmG. Anticorpii formați împotriva acestor antigene sunt cei mai specifici pentru bolile mixte ale țesutului conjunctiv - de ex. dacă aveți simptome de sclerodermie, artrita reumatoida, LES, polimiozită (aproximativ 95% din cazuri) și într-o măsură mai mică pentru LES (până la 30% din cazuri).
6. Jo-1 este o enzimă ARN sintetază de transfer de aminoacil. Autoanticorpii la această proteină sunt semnificativi din punct de vedere diagnostic pentru miozită (polimiozită/dermatomiozită).
7. CENP-B (Centromer) - pentru detectarea anticorpilor Anti-Centromer (Anti-Centromer B), în scopul diagnosticării sindromului CREST (acest sindrom este o combinație de calcificare a pielii, sindrom Raynaud, tulburări de motilitate esofagiană, sclerodactilie, telangiectazie). Sindromul CREST se referă la o variantă a sclerozei sistemice (scleroza sistemică). Acești anticorpi la pacienți indică o evoluție favorabilă a sclerodermiei sistemice și indică leziuni ușoare ale organelor interne.
8. Celulele Hep-2 sunt celule de carcinom epitelial laringian uman din linia Hep-2 care conțin mulți antigeni nucleari diferiți, inclusiv antigenul SS-A (Ro) și antigenele centromerice. Anticorpii împotriva Hep-2 se găsesc la pacienții cu polimiozită și dermatomiozită în până la 90% din cazuri.
9. Mitocondrii (PDC) - PDC - complex de piruvat dehidrogenază. Un grup mare de anticorpi antimitocondriali sunt autoanticorpi care se formează împotriva enzimelor complexului de piruvat dehidrogenază, situate în mitocondriile celulelor și implicate în decarboxilarea oxidativă a piruvatului.

ANA se găsesc adesea în ciroza biliară.

AHA, în general, nu pătrund în celulele vii și, prin urmare, sunt inofensive. Dar uneori formează complexe antigen-anticorp care provoacă leziuni tisulare (ca în LES, afectarea rinichilor). Datorită implicării multor organe în procesul patologic, valoarea diagnostică a determinării AHA este mică, iar rezultatele analizei confirmă doar parțial datele clinice.

Pe lângă bolile reumatice, ANA se găsesc și în hepatitele cronice active în până la 50% din cazuri. Aspectul (titruri scăzute) este posibil când boli inflamatorii, oncologie și infecții virale.

• Frecvența comparativă de detectare a anticorpilor antinucleari.
  

  Boală și stare	Frecvența de detectare, %
  SLE	95-100
  Hepatita lupoida (nume nou - hepatita cronica autoimuna)	70 -80%
  Sindromul Felty (Felty. 1924) - artrită reumatoidă + splenomegalie + neutropenie + leucopenie + limfadenopatie.	95-100
  Sclerodermie sistemică	75-80
  Sindromul lupus indus de medicamente (hidralazină, procainamidă, izoniazidă)	Aproximativ 50
  Sindromul Sjögren (Afectarea sistemică autoimună a țesutului conjunctiv. Caracterizat prin implicarea glandelor exocrine, în principal salivare și lacrimale, în procesul patologic, și un curs cronic progresiv).	40-75
  Rudele clinic sănătoase ale unui pacient cu LES	Aproximativ 25
  Lupus eritematos discoid	15-50
  Artrita juvenila cronica, artrita reumatoida	15-30
  Periarterita nodoasă	15-25
  Dermatomiozita si polimiozita	10-30
  Reumatism	Pe la 5
  sindromul Raynaud	15-20

Pe baza anticorpilor și determinând concentrația acestora în plasma sanguină, sunt diagnosticate multe afecțiuni ale corpului. Unul dintre indicatori este factorul antinuclear, care combină sub numele său un grup de anticorpi de diferite tipuri direcționați împotriva componentelor celulare. Atunci când este identificat un astfel de factor, are sens să vorbim despre o boală autoimună, în special lupusul eritematos sistemic.

Deși testul este universal pentru determinarea multor patologii sistemice ale corpului, în special, o boală atât de gravă precum lupusul eritematos, unele caracteristici interesante sunt asociate cu acesta. A început să fie folosit din 1957, dar tehnica s-a răspândit abia de la sfârșitul anilor 80 ai secolului trecut. Este de remarcat faptul că prezența implanturilor în sân crește titrul de anticorpi antinucleari, care se observă de la 5% la 55% din toate cazurile la pacientele de sex feminin.

Ce sunt ei?

Complexul de anticorpi, care include factorul antinuclear, este reprezentat de peste 200 de indicatori, cel mai adesea aceștia sunt imunoglobuline de clasă G, în cazuri rare IgM și IgA. Ele apar în patologii caracterizate printr-o natură autoimună sau reumatică a leziunii ca urmare a toleranței afectate a sistemului imunitar la propriile țesuturi.

În unele condiții, sistemul imunitar își direcționează toate forțele nu pentru a lupta împotriva factorilor străini, ci împotriva propriilor țesuturi și celule, ceea ce în mod normal nu ar trebui să se întâmple. Toleranța față de anumite celule către care este îndreptată agresiunea este ruptă și se dezvoltă o boală autoimună. Anticorpii produși în timpul procesului bolii, sau complecși, sunt numiți autoimuni.

Mulți oameni au cantități mici de autoanticorpi, dar acesta nu este un semn de boală. Doar o perturbare serioasă a sistemului imunitar poate duce la o creștere a nivelului de autoanticorpi, acesta este un motiv pentru a face un diagnostic adecvat. Dar trebuie totuși completat de alte studii, în special sânge, urină, precum și manifestări clinice.

La o persoană care suferă de lupus eritematos sistemic, ANF crește chiar înainte de apariția primelor simptome. Dintre toți pacienții, 95% au factor antinuclear crescut în sânge, care este completat de simptomele bolii, care, la rândul lor, confirmă diagnosticul.

Mecanismul de apariție al factorului

Există mai multe motive care contribuie la dezvoltarea bolii la om. Totul se întâmplă într-o anumită secvență:

1. Sub influența radiațiilor ultraviolete de la soare piele sunt lansate procese de moarte celulară pre-programată genetic, care se numește apoptoză. Aceasta este o reacție normală a organismului, totuși, în bolile de natură sistemică, limfocitele încep să migreze intens.
2. Componentele celulelor inaccesibile anterior, invizibile, devin accesibile sistemului imunitar, în special membrana celulară, nucleolii, histonele, membrana nucleară și altele. Ei devin goi, iar macrofagele, în loc să recicleze un astfel de material, transmit mai departe informații, provocând răspunsul imunitar al organismului.
3. Limfocitele B răspund la semnalul dat de macrofag, producând anticorpi antinucleari ei interacționează cu antigenul corespunzător, formând un complex;
4. Complexele sunt depuse pe membranele organelor și țesuturilor, acest lucru se produce din interior pe suprafața peretelui vasului sau se activează un răspuns imun local.
5. Daunele afectează funcția organelor.

Analize, indicații

Există mai multe indicații când este prescris un test de anticorpi antinucleari. În primul rând, există suspiciunea de dezvoltare a lupusului eritematos sistemic, sindromul Sjogren. Dacă există unul boala sistemica, medicul suspectează altceva, de exemplu, sindromul antifosfolipidic se poate dezvolta pe fondul lupusului.

Simptome și când trebuie testat

Există întotdeauna simptome, a căror apariție ar trebui să alerteze o persoană și să o oblige să se supună examinării. Medicul trebuie să orienteze pacientul dacă există:

1. Artrita, manifestată prin inflamarea articulației, cu durere, umflături, mobilitate redusă, roșeață a pielii deasupra acesteia și creșterea temperaturii.
2. O examinare pentru pericardită și pleurezie, a căror cauză nu este cunoscută, nu ar strica.
3. Leziuni renale asociate cu o tulburare a sistemului imunitar, apariția unor modificări în analiza urinei, în special proteine, sânge.
4. O altă indicație este varianta hemolitică a anemiei, în care globulele roșii sunt distruse în cantități mari, nivelul bilirubinei din sânge și testul de urină crește.
5. Indicația este o scădere a nivelului de trombocite și neutrofile din formula leucocitară.
6. Manifestări pe piele sub formă de erupții cutanate, îngroșări care apar după expunerea la soare.
7. Sindromul Raynaud, în care degetele de la mâini și de la picioare își schimbă periodic culoarea. Ele devin palide, albastre sau roșii, sensibilitatea este afectată și durerea este îngrijorată.
8. Indicația este simptomele necaracteristice din neurologie sau psihiatrie.
9. Dacă temperatura crește, se dezvoltă oboseala, greutatea corporală scade și ganglionii limfatici se măresc.

Tipuri de cercetare

Există două metode care vă permit să determinați anticorpii antinucleari în sânge. Prima se numește microscopie cu imunofluorescență indirectă. Linia ei de celule a fost derivată dintr-un adenocarcinom la laringe. Dacă există anticorpi antinucleari, aceștia se leagă de antigeni specifici, după care se adaugă etichete care pot străluci într-un anumit spectru de lumină. La microscop, devine posibil să se determine intensitatea și tipul strălucirii.

Această tehnică este recunoscută ca fiind cea mai bună pentru determinarea nivelului de anticorpi antinucleari. Are un alt nume - benzi de test pentru lupus.

Rezultatul studiului este titrul sau diluția maximă a sângelui care dă strălucirea. Dacă rezultatul este pozitiv, este descris tipul de strălucire. Titrul crește cu o acumulare mare de anticorpi. Un titru scăzut poate fi considerat un rezultat negativ, în timp ce un titru ridicat poate indica faptul că concentrația de anticorpi antinucleari este în creștere.

A doua opțiune de diagnosticare este imunotestul enzimatic. Esența sa este că anticorpii care se află în sânge intră în contact cu antigenul corespunzător, rezultatul este că soluția își schimbă culoarea.

Este de remarcat faptul că un rezultat pozitiv al testului nu este un diagnostic 100%. Acesta este un semnal că este necesară o examinare suplimentară, care va ajuta la identificarea bolii în perioada incipientă și la prescrierea tratamentului. Dacă testul pentru factorii antinucleari este negativ, putem vorbi de absența lor completă, dar nu este exclus diagnosticul unei suspecte de patologie autoimună.

Este obligatoriu sa faci analize de sange pt diverși indicatori. Cu toate acestea, merită să ne amintim că rezultatele pot fi afectate de luarea anumitor medicamente, precum și acute sau boli cronice. Un specialist vă va ajuta întotdeauna să înțelegeți toate complexitățile, după care va stabili un diagnostic și va recomanda ce să faceți în continuare.

Factorul antinuclear pe linia celulară HEp-2 (ANF) este un test pentru detectarea anticorpilor antinucleari folosind imunofluorescența indirectă.

În lupusul eritematos sistemic (LES) și alte boli reumatismale sistemice, răspunsul imun este îndreptat împotriva antigenelor nucleoproteice, de exemplu. complexe de acizi nucleici și proteine. Aceste complexe nucleoproteice endogene se formează în timpul procesului de apoptoză a celulelor epiteliale și seamănă cu particule virale străine. Accelerarea proceselor de apoptoză sub influența iradierii ultraviolete, infecții viraleȘi medicamente, declanșează răspunsuri autoimune în LES. În timpul apoptozei, antigenele majore ale anticorpilor se condensează în corpi apoptotici, care devin ținte pentru autoanticorpi. În prezent, au fost descrise aproximativ 200 de tipuri de anticorpi la nucleoproteine ​​și riboproteine. acizi nucleici, care se numesc anticorpi antinucleari. În bolile autoimune, autoanticorpii la antigenele nucleare nu au un efect citotoxic direct asupra celulelor umane, cu toate acestea, complexele imune sunt capabile să declanșeze inflamații imunologice, în special în locurile în care vasele sunt deosebit de subțiri, inclusiv rinichii, pielea, sistemul nervos central, sinoviala articulațiilor și pleura.

Testarea factorului antinuclear (ANF) este metoda principală de detectare a anticorpilor antinucleari, permițând detectarea autoanticorpilor la acizii nucleici (dsDNA, ssDNA, ARN), ribonucleoproteinele, precum și majoritatea antigenelor conformaționale și insolubile.

Anticorpii antinucleari sunt detectați prin legarea lor la antigenele intracelulare ale unei linii celulare epiteliale umane continue (HEp-2). Nucleul și citoplasma celulelor HEp-2 conțin toate antigenele caracteristice corpului uman, ceea ce face posibilă detectarea tuturor anticorpilor antinucleari majori într-un singur test. Metoda de imunofluorescență indirectă pe linia celulară HEp2 este recomandată ca standard de aur pentru detectarea anticorpilor antinucleari de către experții de top europeni (EASIgroup2010) și americani (ACRANATaskforce2008). Datorită diversității antigenelor de anticorpi antinucleari, nu toți pot fi purificați sau sintetizați pentru utilizare în imunotestele enzimatice pentru detectarea anticorpilor antinucleari.

Pozitivitatea pentru ANF pe linia celulară HEp-2 este observată în lupusul eritematos sistemic (LES), bolile reumatice sistemice și multe boli autoimune, ceea ce îl face un test universal în examinarea pacienților cu patologie autoimună. Un rezultat pozitiv al ANF este observat la peste 90% dintre pacienții cu boli difuze ale țesutului conjunctiv, cum ar fi lupusul eritematos sistemic și formele cutanate această boală, sclerodermia și varietățile sale, boala mixtă a țesutului conjunctiv, sindromul Sjogren. Detectarea ANF este de mare importanță în diagnosticul poliartritei reumatoide juvenile și al bolilor hepatice autoimune. Reprezentanții acestei familii de autoanticorpi pot fi găsiți într-o varietate de alte tipuri autoimune (tiroidită, diabet), infecțioase (hepatită virală), inflamatorii și boli oncologice. Incidența ANF ajunge la 1-3% la persoanele sănătoase clinic și crește ușor la persoanele peste 65 de ani. Persoanele cu titruri mari de ANF au un risc crescut de a dezvolta boli autoimune.

Indicatii:

• Lupus eritematos sistemic.
• Lupus cutanat subacut și alte tipuri de lupus cutanat.
• Boala mixtă a țesutului conjunctiv.
• Sindromul Sjögren și bolile asociate.
• Sclerodermie difuză și localizată, sindrom CREST.
• Miopatii inflamatorii (polimiozita si dermatomiozita).
• Artrita cronică juvenilă.
• Hepatită autoimună.
• Ciroză biliară primară și colangită sclerozantă.
• Polineuropatie și mielită.

Pregătirea


Se recomandă donarea de sânge dimineața, între orele 8 și 12. Sângele se ia pe stomacul gol sau la 4-6 ore după ultima masă. Este permis să bei apă fără gaz și zahăr. În ajunul examinării, supraîncărcarea alimentară trebuie evitată.

Interpretarea rezultatelor
Unități de măsură: titrul.

Valori de referinta:<1:160 (отрицательно).

Rezultatul determinării ANF este titrul, care este valoarea diluției finale a serului la care rămâne fluorescența semnificativă a nucleului. Cu cât numitorul fracției este mai mare, cu atât diluția serului este mai mare, cu atât mai mulți anticorpi sunt în serul pacientului. Titrurile mari de diluție a serului reflectă afinitate și concentrație ridicată de autoanticorpi.

Detectarea unor niveluri ridicate (1/640 și peste) indică o probabilitate mare de apariție a bolii reumatismale sistemice sau a bolii hepatice autoimune și necesită o examinare clinică, de laborator și instrumentală atentă. Absența titrurilor crescute de factor antinuclear reduce semnificativ probabilitatea bolilor autoimune sistemice.

La titruri mici (până la 1/160), factorul antinuclear poate fi observat la 1-2% dintre indivizii sănătoși și rudele pacienților cu boli sistemice. Frecvența titrurilor pozitive în populație crește ușor odată cu vârsta. Titruri scăzute de anticorpi antinucleari pot apărea în multe boli autoimune, infecțioase și oncologice. Absența titrurilor mari de anticorpi antinucleari reduce semnificativ probabilitatea unui proces reumatic sistemic și poate fi folosită pentru a exclude mai degrabă decât a confirma diagnosticul.

Boli reumatismale sistemice
Factorul antinuclear (ANF) și tipul de luminiscență

Determinarea factorului antinuclear (ANF) este metoda principală de detectare a anticorpilor antinucleari, care permite detectarea majorității tipurilor de anticorpi antinucleari, inclusiv autoanticorpi la acizii nucleici (dsDNA, ssDNA, ARN), antigeni conformaționali și insolubili. Rezultatul determinării ANF este prezența autoanticorpilor în titrul de diagnostic, titrul final al diluției serului, reflectând afinitatea și concentrația autoanticorpilor, precum și tipul de luminescență a nucleului celular. (test 01.02.15.005). Caracteristicile unei anumite tehnici depind în primul rând de alegerea substratului, care poate varia de la criosecții (ficat sau rinichi de șobolan) la linii celulare proliferative cultivate (Hep2, Kb, HeLa), precum și metoda de fixare a țesuturilor, care poate afecta conservarea unui număr de antigene nucleare ANA.

Istoricul dezvoltării testelor pentru detectarea anticorpilor antinucleari:

Începutul secolului al XX-lea - „corpi hialini” în citoplasma leucocitelor

1948 Hargraves, Richmond, Morton - metodă pentru detectarea in vitro a celulelor LE în timpul incubației pe termen lung a leucemiei de la pacienții cu LES

1951 Lee, Michael, Vural - a descoperit un factor seric care stimulează fagocitoza nucleelor ​​limfocitelor de către leucocitele din sângele periferic

1957 Holoborow, Weir, Johnson a folosit metoda de imunofluorescență indirectă dezvoltată de Coons în 1950 pentru a detecta ANF în criosecțiuni ale ficatului uman

1961 Beck - țesut folosit de la animale de laborator

1982 Tan - a folosit linia celulară continuă umană HEp-2, acest test a devenit standardul de aur pentru detectarea ANA

1958 Jones - a descoperit în sângele pacienților cu sindrom Sjögren un factor capabil să precipite extracte de nuclee celulare, care a servit drept imbold pentru descrierea majorității soiurilor de anticorpi antinucleari

Imunofluorescență indirectă pe linia celulară continuă Hep2

O metodă pentru detectarea ANF a fost dezvoltată de Tan (1982), care a folosit linia de celule epitelioide umane continuă HEp-2 (ATCC nr. de ref. CCL-23) ca substrat. Această linie celulară, derivată din adenocarcinomul laringian uman, este o celulă epitelială scuamoasă poliploidă mare, nekeratinizantă, care formează un monostrat pe plastic și sticlă.

Figura: celule ale liniei celulare HEp-2, colorate cu colorant hematologic.

Nepretenția comparativă a acestei linii, nucleele mari și prezența tuturor antigenelor umane au făcut din metoda imunofluorescenței indirecte folosind linia celulară continuă HEp-2 principala metodă de detectare a ANF. În literatura în limba engleză nu există un singur nume pentru această metodă, uneori, această metodă este denumită FANA (detecție fluorescentă a anticorpilor antinucleari). Lipsa de unitate în nomenclatură a dat naștere la confuzie în numele testelor de laborator. Uneori, termenul „anticorpi antinucleari” este folosit de laboratoarele imunologice pentru a se referi la testele bazate pe imunotestul enzimatic și metodele de analiză imunochimică, precum și metoda imunofluorescenței. În literatura în limba rusă, considerăm că este necesar să păstrăm denumirea națională pentru acest indicator - „factor antinuclear” (ANF) pentru a distinge metoda imunofluorescentă de alte teste pentru detectarea ANA.

Este necesar să se identifice ANF din clasa IgG, deoarece detectarea ANF reprezentată de alte clase de imunoglobuline nu are valoare diagnostică independentă. Diluțiile standard ale serului pacientului sunt incubate cu substrat tisular, permițând anticorpilor antinucleari din serul pacientului să se lege la țintele nucleare adecvate. Siturile de legare a autoanticorpului sunt apoi detectate utilizând antiser anti-uman marcat cu fluoresceină.

Deși alte linii celulare umane pot fi folosite ca substraturi, datorită morfologiei lor bune și ușurinței de cultivare, Hep-2 a devenit un substrat general acceptat pentru imunofluorescența indirectă. Utilizarea acestuia îmbunătățește sensibilitatea testului datorită fluorescenței strălucitoare chiar și cu diluții semnificative ale serului pacientului, iar nucleul mare, bogat în eucromatină, permite o descriere precisă a tipului de fluorescență. În plus, utilizarea liniei de celule Hep-2 facilitează detectarea anticorpilor Ro/SS-A, precum și a anticorpilor la antigenele nucleolare, care sunt sărace atunci când se utilizează criosecțiuni ale țesutului animal de laborator. Alte avantaje ale HEp-2 includ o frecvență ridicată a diviziunii celulare, ceea ce face posibilă detectarea anticorpilor la antigenele exprimate numai în timpul diviziunii celulare și absența unei matrice celulare tisulare, ceea ce face dificilă vizualizarea luminiscenței specifice în comparație cu cea histologică. secțiuni.

Titruri de factor antinuclear

Titrul ANF este definit ca ultima diluție a serului pacientului, care are o fluorescență clară a nucleilor celulari. Când se utilizează țesuturi de animale de laborator, titrul de diagnostic ANF este de 1:8-1:10, în timp ce când se utilizează linia celulară HEp-2, se recomandă utilizarea unui titru inițial de 1:80. În acest caz, titrurile normale ANF sunt mai mici de 1:160.

Când se utilizează titruri mai mici de 1:160, frecvența rezultatelor slab pozitive la indivizii sănătoși clinic nu va fi mai mare de 5% și, în același timp, nu va permite ratarea unor titruri semnificative de ANA la pacienții cu boli difuze ale țesutului conjunctiv.

Pentru a determina titrul final, se utilizează de obicei titrarea în x2 pași (1:160-1:320 - 1:640 - 1:1280 - 1:2560 - 1:5120 etc. Se poate folosi și titrare mai grosieră. Pe fundal de exacerbare a bolilor reumatice se observă de obicei titruri ANF mai mari de 1:640, iar în timpul remisiunii titrurile scad la 1:160-1:320.

Există recomandări pentru notarea rezultatelor identificării ANF, indicând conținutul „în cruci”. Acest lucru permite laboratoarelor să economisească reactivii și să reducă costurile cu forța de muncă pentru cercetare. În acest caz, determinarea titrului final nu este posibilă. Trebuie avut în vedere faptul că titrul final este mai important decât cantitatea de autoanticorpi legați de substrat, deoarece este direct legat de afinitatea interacțiunii lor cu antigenul. Este recomandabil să se determine titrul final la toți pacienții pozitivi, ceea ce face posibilă clarificarea prezenței în ser a autoanticorpilor de mare afinitate, care sunt mai strâns legate de activitatea procesului.

Tipul de luminescență a nucleului factorului antinuclear

Deja în prima experiență a utilizării clinice a imunofluorescenței indirecte pentru a detecta ANF folosind criosecțiuni ale țesuturilor de laborator, s-a remarcat că serul pacienților cu boli autoimune a „colorat” nucleii celulari în mod diferit, ceea ce a condus la luminiscența selectivă a unor structuri nucleare. Clarificarea acestui fenomen a condus la descrierea așa-numitelor „tipuri de luminescență” a nucleului în testul de imunofluorescență. Acest lucru se datorează faptului că fiecare tip de ANA are ținte celulare specifice, drept urmare tipul de luminiscență a nucleului, nucleolului și citoplasmei celulei reflectă interacțiunea ANA din serul pacientului cu structurile care conțin antigen în interior. celula. Tipul de luminescență depinde de prezența autoanticorpilor specifici în serul sanguin al pacientului, pe baza cărora se poate face o concluzie preliminară cu privire la tipurile de ANA care sunt prezente în acest ser. Cu toate acestea, utilizarea secțiunilor histologice de țesut de la animale de laborator nu permite stabilirea în mod fiabil a tipului de luminiscență. În același timp, utilizarea liniilor celulare continue, cum ar fi Hep-2, face posibilă descrierea unui număr semnificativ de variante de colorare nucleară și citoplasmatică. Există trei grupe principale de antigeni, prezența anticorpilor la care determină diferite tipuri de luminiscență:

Tipul de luminescență a nucleului celular crește semnificativ conținutul de informații de identificare a ANF și, prin urmare, ar trebui determinat în mod obișnuit la determinarea acestui indicator. Utilizarea celulelor HEp-2 face posibilă caracterizarea a peste 20 de variante diferite de colorare nucleară, care depind de spectrul de ANA prezente în serul studiat. Cu toate acestea, pentru un laborator practic este suficient să se facă distincția între 6 opțiuni principale pentru legarea autoanticorpilor la structurile celulare care conțin antigen.

Există tipuri omogene, periferice, granulare (mice/mari), nucleolare, centromerice și citoplasmatice de luminiscență nucleară. Fiecare tip de luminescență are trăsături foarte caracteristice care fac posibilă distingerea unei opțiuni de alta, precum și un set de antigeni cu care autoanticorpii reacționează în serul pacienților. Descrierea tipurilor de luminiscență oferă informații clinice valoroase în sine, în plus, tipul de luminiscență poate indica necesitatea anumitor teste de laborator în viitor.

La tip omogen strălucire autoanticorpii reacţionează cu acele antigene care sunt distribuite difuz în nucleu, adică. fac parte din cromatina. În mod obișnuit, atunci când este detectat un tip omogen de luminescență, cromozomii condensați sunt viu colorați în celulele în diviziune. Principalele unități structurale ale cromatinei sunt nucleozomii - complexe de ADN și histone. Astfel, tipul omogen de luminescență sugerează prezența anticorpilor împotriva nucleozomilor, dsDNA și a anticorpilor la histone. Apare la pacienții cu LES și lupus indus de medicamente, precum și la pacienții cu sclerodermie. De obicei, detectarea unui titru ridicat de ANF cu un tip omogen de luminescență indică un diagnostic de LES.

Tip periferic strălucirea este adesea izolată separat, deși este un tip de strălucire omogenă. Detectarea sa este un artefact al fixării celulare, care duce la redistribuirea cromatinei în nucleu către periferie. Este important să se distingă tipul periferic de luminescență de colorarea membranei nucleare, care se observă în bolile hepatice autoimune. Tipul periferic de luminescență se găsește la pacienții cu anticorpi la ADN-ul dublu catenar și este detectat în principal la pacienții cu LES.

Tip granular este cea mai comună și, în același timp, cea mai nespecifică. Uneori, acest tip de strălucire în literatura rusă este numit „pătat” sau „plasă”. Numele „granular” reflectă mai exact acest fenomen, deoarece în acest caz autoanticorpii reacţionează cu granulele din nucleu, care sunt complexe nucleoproteice supramoleculare. Astfel de complexe de proteine ​​și acizi nucleici îndeplinesc o serie de funcții în nucleu care sunt necesare pentru funcționarea normală a celulei. Astfel de complexe, în special, includ spliceozomi, care efectuează rearanjarea post-transcripțională a ARNm necesară pentru sinteza proteinelor pe ribozomi. Compoziția conține multe nucleoproteine ​​diferite, ceea ce determină diversitatea țintelor antigenice la detectarea unui tip granular de luminescență. Principalii autoantigeni, anticorpi la care conduc la vizualizarea tipului granular de luminescență, includ antigenele Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B și PCNA. În timpul procesului de diviziune celulară, celulele pierd majoritatea complexelor nucleoproteice formate, prin urmare, figurile mitotice dintr-o linie celulară cu un tip de luminiscență granulară nu sunt colorate. Tipul granular de luminiscență nucleară este observat la pacienții cu LES, SS, SS, DM/PM, RA și o serie de alte boli autoimune. Titrurile scăzute de ANF de tip granular predomină în serurile sanguine ale indivizilor sănătoși clinic cu ANF fără semne de boală sistemică.

Detectarea titrurilor ANF foarte mari (1:2560-1:10000) cu tip granular grosier luminiscența nucleară indică de obicei un diagnostic de boală mixtă a țesutului conjunctiv și necesită o examinare suplimentară pentru a identifica antigenul RNP, care este principalul marker serologic al acestei boli.

Antigenele nucleolare pot acționa ca ținte ale ANA, ducând la detectarea tip nucleolar fluorescenţă. Identificarea tipului nucleolar de strălucire este caracteristică sclerodermiei și varietăților sale. Tip nucleolar fluorescenţă determinată la pacienții cu anticorpi la componentele nucleolului, cum ar fi ARN polimeraza 1, NOR, U3 RNP, PM/Scl.

tip centromer fluorescența este observată atunci când apar anticorpi la centromerii cromozomilor și se găsește numai în celulele în diviziune. Prezența sa este caracteristică variantei CREST a sclerodermiei.

Tipul citoplasmatic strălucirea indică anticorpi la sintetazele ARNt, în special Jo-1, care se observă în polimiozită. În plus, este detectat la pacienții cu ANA direcționat împotriva altor componente ale citoplasmei celulare: anticorpi la actină în hepatita autoimună, anticorpi la mitocondrii în ciroza biliară primară.

O serie de alte tipuri de luminiscență pot fi caracterizate și aceste tipuri de colorare a nucleului celular pot fi caracteristice unui anumit tip de ANA. Astfel, anticorpii la Scl-70 într-un test imunofluorescent pe celule HEp-20 dau colorare cu granulație fină a nucleului și nucleolilor, anti-p80 - puncte luminoase în nucleu, care sunt absente în celulele mitotice. Cu toate acestea, este necesar să subliniem raritatea și diversitatea unor astfel de fenomene, ceea ce face ca identificarea lor în timpul cercetărilor de rutină să fie inutilă.

O combinație de mai multe tipuri de luminiscență poate apărea adesea, de exemplu, fin-granulară și nucleolară, ceea ce este tipic pentru anticorpii la Scl-70. Mai mult decât atât, adesea în diluții mici predomină un tip de fluorescență, de exemplu granulară, iar cu diluții ulterioare sunt relevate tipuri omogene sau centromerice de fluorescență, ceea ce indică prezența diferitelor tipuri de ANA în serul pacientului. Deși tipul de strălucire oferă medicului anumite date în favoarea unui anumit diagnostic, este necesar să se țină cont de specificitatea sa relativ scăzută și de varietatea fenomenelor întâlnite, ceea ce necesită o examinare suplimentară de laborator.

Detectarea ANA este baza pentru utilizarea altor teste de laborator care clarifică spectrul ANA în sângele pacienților. Având în vedere conținutul extrem de informații al acestui test, testarea și analiza ulterioară a rezultatelor unei examinări ulterioare ar trebui interpretate în funcție de rezultatele evaluării tipului de luminescență și a titrului ANF.

Deși absența titrurilor semnificative de ANA exclude aproape întotdeauna diagnosticul de boală reumatică sistemică activă, atunci când se utilizează linia celulară HEp-2, la 2-4% dintre pacienții care îndeplinesc criteriile pentru diagnosticul de LES, ANA nu sunt detectate sau titrurile sunt scăzut. Acești pacienți sunt uneori clasificați ca „ LES ANF-negativ„Pentru a clarifica diagnosticul la astfel de pacienți, este necesară o examinare suplimentară, în primul rând identificarea anticorpilor la antigenele SS-A. Acești antigeni sunt foarte solubili și se pot pierde din nucleele celulare. Pentru a reduce această categorie de pacienți, se folosesc teste complexe, inclusiv determinarea anticorpilor la antigenele nucleare extrase, așa-numitele „ screening pentru bolile țesutului conjunctiv», test 000723. Un rezultat negativ al unei astfel de examinări permite, cu o probabilitate foarte mare, excluderea diagnosticului de LES și alte boli reumatismale sistemice.

O metodă de cercetare folosind celule epiteliale umane HEp-2, care permite detectarea anticorpilor antinucleari - unul dintre markerii bolilor sistemice ale țesutului conjunctiv.

Sinonime rusă

ANF, anticorpi antinucleari, anticorpi antinucleari (ANA).

Sinonime în engleză

Anticorpi antinucleari (ANA), substrat Hep-2, ANA-Hep2, detectarea anticorpilor antinucleari fluorescent (FANA).

Metodă de cercetare

Reacție indirectă de imunofluorescență.

Ce biomaterial poate fi folosit pentru cercetare?

Sânge venos.

Cum să vă pregătiți corect pentru cercetare?

Nu fumați timp de 30 de minute înainte de a dona sânge.

Informații generale despre studiu

Determinarea factorului antinuclear (ANF) este „standardul de aur” pentru detectarea anticorpilor antinucleari (ANA) și diagnosticarea bolilor autoimune.

Patogenia bolilor sistemice ale țesutului conjunctiv (SCTD) este strâns legată de tulburările sistemului imunitar și producția crescută de anticorpi la structurile propriilor celule. Autoanticorpii la componentele nucleului celular - anticorpi antinucleari - interacționează cu acizii nucleici și proteinele nucleare, antigenele citoplasmatice, care se manifestă prin modificări inflamatorii la nivelul țesuturilor și organelor, dureri în articulații și mușchi, oboseală severă, scădere în greutate și modificări ale pielii. ANA se găsesc în multe boli autoimune, dar sunt cele mai frecvente în lupusul eritematos sistemic (LES). ANA apar la peste 90% dintre pacienții cu boli sistemice ale țesutului conjunctiv, în prezent au fost descrise aproximativ 200 de soiuri, care sunt unite printr-un singur nume - factor antinuclear;

La determinarea ANF prin fluorescență indirectă, linia continuă de celule epiteliale a adenocarcinomului laringian uman HEp-2 este cel mai des utilizată. Celulele HEp-2 sunt un substrat foarte convenabil pentru cercetarea de laborator, deoarece au nuclee mari și cresc într-un singur strat pe lamele de sticlă. ANA-urile sunt detectate prin legarea la antigenele intracelulare ale celulelor HEp-2.

În timpul studiului, celulele epiteliale HEp-2 sunt crescute pe lame de sticlă, fixate și incubate cu ser diluat pentru pacient. După îndepărtarea excesului de ser, celulele sunt incubate cu anticorpi marcați cu fluoresceină, apoi spălate din nou și examinate la microscop cu fluorescență. În acest caz, se determină titrul de anticorpi și tipul de strălucire. Un titru mai mare de 1:160 este considerat semnificativ din punct de vedere diagnostic. În timpul exacerbării bolilor reumatice, depășește 1:640, iar în timpul remisiunii scade la 1:160-1:320. Cu cât sunt mai mulți anticorpi, cu atât titrul este mai mare. Pe baza tipului de strălucire, este posibilă identificarea țintelor anticorpilor antinucleari, ceea ce are o mare importanță clinică și determină tactica pentru examinarea ulterioară a pacientului. Principalele sunt colorații nucleare periferice, granulare (mice/mari), nucleolare, centromerice și citoplasmatice. Fiecare tip de strălucire are trăsături foarte caracteristice care fac posibilă distingerea unei opțiuni de alta.

Colorația omogenă (difuză) este asociată cu prezența anticorpilor la ADN-ul dublu catenar, histonele și este caracteristică LES și lupusului indus de medicamente.

Luminescența periferică este cauzată de distribuția periferică a cromatinei în nucleu, este asociată cu anticorpi la ADN și este specifică pentru LES. Este important să se diferențieze acest tip de luminescență de colorarea membranei nucleare, care apare în bolile hepatice autoimune.

Colorația granulară (pestrită, reticulară) este cea mai frecventă și mai puțin specifică este detectată în multe boli autoimune. În acest caz, autoantigenele sunt complexe nucleoproteice din nucleu (antigeni Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B și PCNA).

Titruri foarte mari de ANF cu un tip de luminescență granulară grosieră indică adesea o boală mixtă a țesutului conjunctiv.

Colorarea nucleară (nucleolară) este cauzată de formarea de anticorpi la componentele nucleolului (ARN polimeraza-1, NOR, U 3 RNP, PM/Scl), detectate în sclerodermie, boala Sjögren. ANA crește uneori în boli endocrine (diabet zaharat tip 1, tiroidite, tireotoxicoză, sindrom poliendocrin), afecțiuni ale pielii (psoriazis, pemfigus), în timpul sarcinii, după transplant de organe și țesuturi, la pacientele hemodializate.

Luminescența centromerului apare în prezența anticorpilor la centromerii cromozomilor și este caracteristică unei forme de sclerodermie – sindrom CREST.

Tipul citoplasmatic de luminiscență este asociat cu anticorpi la ARNt sintetaza, în special la Jo-1, care este caracteristic dermatomiozitei și polimiozitei. Acest tip de colorare este determinat și în prezența anticorpilor la alte componente ale citoplasmei în hepatita autoimună și ciroza biliară primară.

Detectarea simultană a diferitelor tipuri de luminescență indică prezența diferitelor tipuri de anticorpi.

La indivizii sănătoși, luminiscența cu granulație fină poate fi detectată la titruri mici, moderate sau ridicate de ANA, dar în mod normal nu ar trebui detectate tipurile de luminiscență cu granulație grosieră sau omogene.

În funcție de rezultatele evaluării tipului de strălucire, sunt dezvoltate tactici suplimentare de tratament pentru pacient și sunt prescrise studii suplimentare pentru a clarifica spectrul ANA.

La ce se folosește cercetarea?

• Pentru diagnosticul bolilor sistemice ale țesutului conjunctiv.
• Pentru diagnosticul diferenţial al bolilor reumatismale.
• Pentru a evalua eficacitatea terapiei pentru bolile autoimune.
• Pentru a monitoriza cursul bolilor sistemice ale țesutului conjunctiv.

Când este programat studiul?

• Pentru simptomele unei boli autoimune (febră prelungită, dureri articulare, oboseală, scădere în greutate, modificări ale pielii).
• La identificarea modificărilor caracteristice bolilor sistemice ale țesutului conjunctiv (VSH crescut, nivelul proteinei C reactive, complexe imune circulante).

Ce înseamnă rezultatele?

Valori de referinta

Rezultat: negativ.

Titlu: 1:160.

Motive pentru creșterea titrului ANF pe celulele HEp-2:

• lupus eritematos sistemic (în 95% din cazuri),
• dermatomiozita/polimiozita,
• sclerodermie sistemică (în 60-90% din cazuri),
• Sindromul Sjogren (în 40-70% din cazuri)
• boala mixtă a țesutului conjunctiv (sindromul Sharpe),
• sindromul Raynaud,
• lupus discoid,
• lupusul indus de medicamente,
• artrita reumatoida,
• vasculită necrozantă,
• Mononucleoza infectioasa,
• leucemie,
• neoplasme maligne (în principal limfom),
• miastenia gravis,
• Infecție endocardită,
• hepatită cronică autoimună,
• ciroza biliară primară a ficatului,
• tuberculoză,
• pneumoconioza,
• fibroza interstițială a plămânilor.

Tipuri de strălucire

Tip strălucitor	Pentru ce este tipic?
Omogen	Pentru LES, lupus indus de medicamente, sclerodermie sistemică, hepatită cronică activă
Periferic
granular	Pentru LES, sindromul Sjögren, boala mixtă a țesutului conjunctiv, artrita reumatoidă
Nucleolar	Pentru polimiozită/dermatomiozită, sclerodermie, sindrom Sjögren, LES
Centromerică	Pentru sindromul CREST (calcinoză cutanată, sindrom Raynaud, disfuncție esofagiană, sclerodactilie, telangiectazie)
Citoplasmatic	Pentru dermatomiozită/polimiozită, boli hepatice autoimune, ciroză biliară primară

Ce poate influența rezultatul?

• Un rezultat fals pozitiv este cauzat de:

• • vârsta peste 60-65 de ani (în 10-37% din cazuri);
  • utilizarea medicamentelor care pot duce la lupus indus de medicamente (acetazolamidă, carbidopa, clorotiazidă, clorpromazină, clofibrat, etosuximidă, săruri de aur, griseofulvină, hidralazină, izoniazidă, săruri de litiu, metildopa, contraceptive orale, penicilină, fenilbutazonă primină, fenilbutazonă, primină) , propiluracil, chinidină, rezerpină, streptomicina, sulfonamidă, tetraciclină, diuretice tiazidice).

• Luarea de glucocorticosteroizi (prednisolon, dexametazonă, metipred) duce uneori la un rezultat fals negativ.

Notite importante

• În 5% din cazurile de LES este posibil un rezultat negativ al acestui test (LES ANF-negativ). În astfel de situații, pentru clarificarea diagnosticului, este necesară determinarea anticorpilor la antigenele SS (Ro).
• Un rezultat pozitiv al testului nu este o dovadă absolută a unei boli autoimune. La persoanele sănătoase, în 3-13% din cazuri, titrul ANF este crescut și ajunge la 1:320.
• Rezultatele testelor trebuie evaluate împreună cu datele clinice și alți parametri de laborator.
• Dacă rezultatul testului este pozitiv, se recomandă determinarea specificității ANA prin imunoblot.

• Anticorpi anti-ADN dublu catenar (anti-dsDNA), screening
• Anticorpi la antigeni nucleari (ANA), screening
• Anticorpi la antigenul nuclear extractibil (screening ENA)
• Anticorpi la cardiolipină, IgG și IgM
• Anticorpi antinucleari (anti-Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENT-B, Jo-1, histone, nucleozomi, Ribo P, AMA-M2), imunoblot